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一起来捉妖六耳猕猴:2019-05-13基于網絡藥理學的黃芪抗疲勞作用機制研究

一起来捉妖免费辅助 www.rpcap.icu  要:目的  基于網絡藥理學方法探討黃芪抗疲勞可能的作用機制。
方法  根據課題組前期研究并結合中醫藥系統藥理學數據庫和分析平臺(TCMSP)指認黃芪中的活性成分,采用PharmMapper網絡服務器預測其作用靶點;在GeneCards、OMIM數據庫中搜索抗疲勞靶點,采用Cytoscape 3.6.0軟件構件黃芪活性成分-抗疲勞靶點網絡;使用String數據庫進行蛋白質-蛋白質相互作用分析,構建蛋白質-蛋白質相互作用網絡,通過度值(degree)篩選關鍵靶點并進行歸屬;使用DAVID數據庫對黃芪抗疲勞作用靶點進行基因本體(GO)富集分析和KEGG通路富集分析,以探究黃芪抗疲勞的作用機制。
結果 獲得黃芪中11種活性成分,包括毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷、芒柄花素、異黃烷、紫檀烷6種黃酮類成分,黃芪皂苷I、II、III、IV 4種皂苷類成分及蔗糖?;棲慰蠱@妥饔迷げ獍械閿?/span>76個,網絡分析結果表明,黃芪主要涉及一氧化氮的生物合成、過氧化氫反應、棕色脂肪細胞分化的正調節、活性氧代謝等生物過程,通過調節癌癥通路,FoxO、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K-蛋白激酶BAkt)、低氧誘導因子-1HIF-1)、血管內皮生長因子(VEGF)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、Ca2+信號通路、氧化應激反應等來發揮抗疲勞作用。
結論 本研究體現了黃芪多成分-多靶點-多途徑的作用特點,為進一步開展黃芪抗疲勞作用機制的研究提供了新思路和新方法。

 

疲勞首見于《金匱要略》[1],隨著現代生活節奏加快和社會競爭激烈,疲勞已經成為普遍的問題。疲勞是一種常見而又復雜的癥狀,生理性疲勞是由大量運動導致體內代謝物累積引起,如果不能及時消除,隨著運動強度和運動量的增大,會出現情緒變化、身體不適、脾胃癥狀和津液損失,表現出亞健康疲勞,這種狀態的進一步發展必將導致五臟機能失調、精氣血耗損,出現慢性疲勞綜合癥[2]。世界上約有10%的人患有慢性疲勞[3],然而其發病機制并不完全明確。有研究表明,疲勞的產生可能與能量代謝、免疫和內分泌系統及抗氧化防御系統的炎癥反應和功能障礙有關[4-6]。

黃芪,始載于《神農本草經》,列為上品[7],為豆科植物膜莢黃芪Astragalusmembranaceus (Fisch.)Bge. 或蒙古黃芪Amembranaceus (Fisch.) Bge. var. mongholicusBge. Hsiao的干燥根,歸肺、脾經,具有補氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津止血等功效,用于氣虛乏力、食少便溏、中氣下陷、氣虛水腫等[8]?;棲沃兄饕煞職ɑ仆?、皂苷類、糖類、有機酸類、氨基酸類等[9]。傳統中醫認為黃芪是補氣良藥,素有“十藥八芪”之稱,文獻研究表明,黃芪具有顯著的抗疲勞[10]、抗炎[11]、抗免疫[12]等作用,但其作用的分子機制不十分明確。因此,借助網絡藥理學的方法挖掘黃芪抗疲勞作用的靶點與通路,從微觀角度科學論證黃芪抗疲勞的作用機制有重要意義。

網絡藥理學融合了系統生物學、多向藥理學、計算生物學、網絡分析等多學科的技術和內容,進行“疾病-表型-基因-藥物”多層次網絡的構建,從整體的角度探索藥物與疾病間的關聯性,具有整體性、系統性的特點,特別適用于多成分、多靶點、多途徑的中藥藥效機制和物質基礎研究[13-15]。本課題組前期研究通過力竭游泳及限制飲食復制疲勞大鼠模型,給予黃芪后疲勞大鼠力竭游泳時間、血清生化指標、病理切片、肌肉代謝組學等結果均顯示黃芪有明顯的抗疲勞效果。因此,本研究以課題組發現的黃芪中主要的初級、次級代謝產物糖類、黃酮類、皂苷類成分為研究對象,采用網絡藥理學方法闡釋黃芪發揮抗疲勞藥效的作用機制,為后續實驗提供理論依據。

1  方法

1.1  黃芪化學成分數據庫的構建

本課題組前期從黃芪中指認出12種次級代謝成分以及氨基酸、有機酸、糖等多種初級代謝成分,結合中醫藥系統藥理學數據庫和分析平臺(TCMSP,//lsp.nwu.edu.cn/,Version 2.3)獲取黃芪的化學成分,并依照實驗室建立的方法[16]對其中的成分進行含量測定。

1.2  化合物分子結構的構建

將上述黃芪活性成分在Chembiodraw Ultra 12.0軟件中繪制出結構圖,并以mol2格式存儲。利用PubChemhttps://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、TCMSP、ChemSpider//www.chemspider.com)、Chemical Book//www.chemicalbook.com/)對其分子結構進行確證。

1.3  黃芪活性成分作用靶點的預測和篩選

將“1.2”項下得到的11個化合物分子結構的mol2格式文件導入到PharmMapper,選取黃芪的潛在作用靶點。利用UniProt數據庫的UniProt KBhttps://www.uniprot.org/uniprot/)搜索功能,導入黃芪蛋白靶點的PDB ID號,限定物種為人,經檢索和轉化操作得到黃芪活性成分的基因靶點。下載每個成分反向對接預測結果,將對接得分(Z)值按照降序排列,選取每個成分的前300個靶點用于后續研究。

1.4  抗疲勞靶點篩選

通過在GeneCards數據庫(//www. genecards.org/,Version 4.5.0)和OMIM數據庫(//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)中輸入關鍵詞fatigue、anti-fatigue,搜索已報道的與疲勞相關的基因,去除重復基因和假陽性基因,與上述作用靶點進行匹配,搜集黃芪活性成分抗疲勞的潛在作用靶點。

1.5  活性成分-抗疲勞作用靶點網絡構建

將黃芪活性成分和抗疲勞作用靶點篩選結果,去除無對應靶點的化學成分,并刪除重復的靶點。將數據導入Cytoscape Version 3.6.0軟件,構建黃芪活性成分-抗疲勞作用靶點網絡。Cytoscape軟件的核心架構是網絡,每個節點(node)是基因、蛋白質或分子,節點與節點之間的連接(edge)代表這些生物分子之間的相互作用,節點的度值(degree)代表網絡中節點與節點相連的數目,度值越大,這個靶點越有可能成為化合物的關鍵作用靶點。

1.6  蛋白相互作用網絡構建與分析

String數據庫(https://string-db.org/,Version 10.5)是一種包含已知和預測的蛋白質-蛋白質相互作用的數據庫。將黃芪的蛋白靶點導入String數據庫,限定物種為人,獲取蛋白相互作用關系,結果保存成TSV格式,保留文件中node1、node2Combinedscore信息并導入Cytoscape軟件繪制相互作用網路,并對網絡進行分析(Cytoscape→Tools→ Networkanalyzer→Networkanalysis→Analyzenetwork),保存網絡分析結果,使用Cytoscape中的Generate style from statistics工具(Cytoscape→Tools→Networkanalyzer→Networkanalysis→Generate style from statistics)將節點大小和顏色設置用于反映度值的大小,邊的粗細設置用于反映結合率評分(Combine score)的大小,獲得最終的蛋白相互作用網絡。

1.7  作用靶點類型歸屬

DisGeNET 數據庫(//www.disgenet.org/ web/DisGeNET/menu,Version 5.0)是包含與人類疾病相關的基因和變體的平臺之一。在DisGeNET數據庫中選用基因進行檢索,將上述黃芪的作用靶點依次導入數據庫中,獲取靶點類型信息(Protein Class)。

1.8  生物過程與通路分析

生物學信息注釋數據庫(DAVID,https:// david.ncifcrf.gov/summary.jsp,Version 6.8)為大規模的基因或蛋白提供系統綜合的生物功能注釋信息,能夠找出最顯著富集的生物學注釋。將黃芪的作用靶點導入DAVID數據庫,SelectIdentifier設置OFFICIAL GENE SYMBOL,List Type設置為GeneList,限定物種為人,對黃芪作用靶點進行基因本體(GO)分析和KEGG通路分析,保存結果。設定閾值P0.05,并按照涉及的靶點數目多少進行排序,篩選排名靠前的生物過程或通路。

1.9  通路圖繪制

利用UniProt數據庫的UniProt KB搜索功能分別獲取黃芪76個抗疲勞靶點的UniprotID。利用KEGG數據庫(//www.kegg.jpKEGG mapping中的KEGG Mapper工具,將上述黃芪關鍵靶點的UniProt ID導入,限定物種為人,獲取黃芪抗疲勞作用的通路圖,篩選排名靠前的幾條通路并進行整合繪制最終的通路圖。

2  結果

2.1  黃芪活性成分的篩選

本研究結合實驗室前期工作共篩選到11種黃芪活性成分(表1),包括6種黃酮類成分毛蕊異黃酮葡苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷、芒柄花黃素、黃芪異黃烷苷、黃芪紫檀烷,4種皂苷類成分黃芪皂苷I、黃芪皂苷II、黃芪皂苷III、黃芪皂苷IV以及蔗糖。

2.2  黃芪活性成分-抗疲勞作用靶點預測

PharmMapper、Chemmapper數據庫得到的所有靶點,刪除重復并去除假陽性,整合后得到11種活性成分靶點231個,由GeneCards、OMIN數據庫檢索整合得到疲勞/抗疲勞靶點861個,將黃芪活性成分對應靶點與疲勞相關靶點取交集得到活性成分-疾病靶點76個,具體信息見表2。

2.3  活性成分-作用靶點網絡構建

使用Cytoscape軟件構建活性成分-抗疲勞作用靶點網絡圖,如圖1所示,共有87個節點,166條邊,其中黃色表示6個黃酮類成分,綠色表示4皂苷類成分,藍色表示蔗糖,粉色表示這些活性成分對應的抗疲勞作用相關靶點。邊代表活性成分與抗疲勞靶點的相互作用。分析結果顯示11種活性成分分別對應11、14、17、10、19、14、19、15、22、16、9個靶點。從韋恩圖(圖2)中可以看出,黃酮類成分作用靶點40個,皂苷類成分作用靶點35個,糖類成分作用靶點9個,其中黃酮類和皂苷類成分共同作用靶點16個,黃酮類成分與蔗糖共同作用靶點4個,皂苷類成分與蔗糖共同作用靶點3個,3類成分共同作用靶點只有1個?;式鶚艫鞍酌?/span>2MMP2)、維生素D受體(VDR)、E3泛素蛋白連接酶(TRIM21)、過氧化氫酶(CAT)、肌紅蛋白(MB)、膽堿激酶βCHKB)等與化學成分關聯度較大,分別與8、7、6、6、5、5個活性成分相關聯。每個活性成分可作用于多個靶點,每個靶點也與多個化合物相關,這說明黃芪在發揮藥效作用時不同化合物具有共同的作用。

2.4  蛋白相互作用網絡構建與分析

如圖3所示,圖中節點表示蛋白,邊表示蛋白之間的關聯,共涉及71個節點,367個邊。度值越大,節點越大,在整個網絡中占的地位越大,通過計算每個節點的拓撲性質尋找黃芪抗疲勞作用的關鍵靶點,在蛋白相互作用網絡中篩選出的度值排名靠前的靶蛋白在黃芪抗疲勞過程中發揮著重要作用。最后選擇21個度值≥15,介數中心性0.020479,中心接近度(closeness)≥0.555555的節點作為主要節點,并將關鍵靶點依次導入DisGeNET數據庫,獲取靶點對應的類型,主要信息見表3。結果表明黃芪抗疲勞過程中有胰島素、信號轉導因子、凝血因子II、神經細胞黏附分子、受體(過氧化物酶體增殖物激活受體、雌激素受體)、蛋白(膜聯蛋白、腫瘤蛋白p53、微球蛋白、熱休克蛋白等)、酶(過氧化氫酶、酪氨酸激酶、一氧化氮合酶、聚合酶、蛋白酶、血紅素加氧酶I、凝血酶)等物質的參與。

2.5  基因功能與通路分析

對篩選得到的21個關鍵靶點進行GO分析和KEGG通路分析。GO富集分析包括生物過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)和細胞組分(cellularcomponent,CC3個分支。設定閾值P0.05,共富集到134條生物過程或通路,篩選靠前的生物過程或通路,用GraphPadPrism 5.0繪圖,見圖47。

如圖4所示,這些靶點主要涉及一氧化氮(NO)的生物合成過程(positiveregulation of nitric oxide biosynthetic process)、過氧化氫反應(response to hydrogen peroxide)、棕色脂肪細胞分化的正調節(positive regulation of brown fat cell differentiation)、活性氧代謝過程(positive regulation ofreactive oxygen species metabolic process)等生物過程。疲勞產生的原因一部分是由于機體能量供應不足,線粒體產生機體中幾乎所有的能量和熱,NO為一種血管擴張劑,可以刺激新的線粒體的合成,能直接調控氧與血紅素的結合與釋放,而且以這種方式控制對線粒體的氧的供給,從而發揮抗疲勞的作用[17]。黃芪總皂苷抗運動性疲勞作用可能與其抑制運動氧化應激所致的自由基增加和改善海馬神經元損傷有關[18]。

MF分析(圖5)中可以看出,靶點主要涉及蛋白質結合(protein binding)、酶結合(enzymebinding)、血紅素結合(heme binding)、蛋白磷酸酶結合(protein phosphatase binding)等分子功能。血紅素加氧酶-1HO-1)是一種誘導性限速酶,它有助于抑制炎性細胞因子,如腫瘤壞死因子TNF-α)、白細胞介素-1βIL-1β)和IL-6的產生,并且已經成為調節炎癥反應和各種疾病中的氧化應激關鍵分子[19]。

CC分析(圖6)可以看出,靶點主要涉及細胞質(cytoplasm)、核(nucleus)、膜(membrane)、細胞外分泌物(extracellular exosome)。核轉錄因子E2相關因子2Nrf2)通常存在于細胞質中,Wang[20]指出藥物抗疲勞可能與Nrf2介導的氧化應激有關。

KEGG通路分析結果(圖7)顯示,黃芪抗疲勞靶點主要涉及FoxO信號通路(5個靶點/23%)、癌癥相關通路(7個靶點/33%)、低氧誘導因子(HIF-1)信號通路(4個靶點/19%),過氧化物酶體(3個靶點/14%)等信號通路。說明黃芪主要活性成分的作用靶點分布在不同的代謝通路,多成分、多靶點相互調節是抗疲勞的可能作用機制。

2.6  靶點通路分析

利用KEGG Mapper工具獲取黃芪抗疲勞的通路圖,將KEGG得出的前10條通路整合繪制通路圖(圖8)。圖中箭頭表示促進作用,T-箭頭表示抑制作用,不同顏色箭頭表示不同的通路。通路靶點標記為藍色,黃芪抗疲勞靶點標記為粉色。圖中顯示出黃芪抗疲勞作用主要涉及了癌癥通路、FoxO、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K-蛋白激酶BAkt)、HIF-1、血管內皮生長因子(VEGF)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、Ca2+信號通路、氧化應激反應、DNA修復過程等,涉及10個黃芪抗疲勞靶點(占黃芪抗疲勞關鍵靶點的49%)。提示黃芪抗疲勞靶點位于這幾條通路中,通過調節其中的幾個環節發揮作用,絕大多數靶點在多條通路中發揮作用,如PI3K、Akt等。

3  討論

黃芪作為補氣良藥,有明顯的抗疲勞作用,然而其作用機制尚不明確。網絡藥理學與中醫藥整體

觀的思想基本一致,有助于系統全面地闡釋黃芪抗疲勞的作用機制。本研究以課題組前期指認出的主要初級、次級代謝成分作為活性成分,共篩選得到毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷、芒柄花素、異黃烷、紫檀烷、黃芪皂苷I、II、III、IV以及蔗糖共11種活性成分,包括6種黃酮類、4種皂苷類以及蔗糖。有研究表明,黃芪皂苷明顯提高運動性疲勞大鼠骨骼肌的過氧化物酶(POD)水平、總抗氧化能力(T-AOC)和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性,降低乳酸脫氫酶(LDH)的含量,具有?;ぴ碩云@痛笫蠹∽櫓淖饔?/span>[21]?;棲沃謝仆喑煞鐘胍恍┢淥喑煞鄭ò碥綻啵┲肝仆計咨追宥鑰蠱@統試鑾孔饔?/span>[22]?;棲味嗵強裳映ば∈蟾褐亓哂斡臼奔?,降低機體血乳酸的積累,增加肝糖原的儲備,起到延緩疲勞發生/提高運動能力的作用,能提高小鼠肝組織中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性,具有抗氧化損傷作用,能?;ぴ碩盞嫉難躉?/span>[23]。

活性成分-作用靶點網絡顯示了黃芪抗疲勞多成分、多靶點的特點,蛋白相互作用網絡表明黃芪的靶蛋白之間存在著相互關系,是一個復雜交錯的網絡,并非單獨發揮作用。本研究結果表明11種活性成分均具有抗疲勞作用,其中黃芪皂苷I、III及毛蕊異黃酮葡萄糖苷、異黃烷連接較多靶點數。胰島素(INS)、IL-10、TP53、CAT等度值較大,是黃芪抗疲勞的主要作用靶點,預測其在黃芪抗疲勞活性中發揮主要作用。INS、CAT是黃酮類和皂苷類化合物的主要作用靶點,INS是多功能的蛋白質激素,對糖、脂肪和蛋白質的代謝起著重要的調節作用[24]。較高的CAT活性有較高的抗氧化功能,可以及時清除體內自由基,減輕過氧化對機體組織細胞的損害和促進疲勞的恢復[25]。IL-10、TP53是蔗糖的主要作用靶點,IL-10是要由Th2細胞所產生的一種細胞因子,是以抑制Th細胞克隆細胞因子合成為特點的多效免疫調節因子,對運動性疲勞的恢復有重要作用[26]。P53是一種腫瘤抑制基因,它所介導的細胞信號轉導途徑在調節細胞正常生命活動中起重要作用,有研究表明,通過抑制大鼠骨骼肌p53蛋白的表達,可減少運動所引起的肌肉細胞凋亡的發生[27]。

富集分析和靶點歸屬分析結果表明,黃芪抗疲勞涉及細胞過程、代謝過程和對應激的應答等生物過程,涉及細胞器、細胞膜和細胞質等細胞組分,涉及小分子、陽離子、金屬離子等分子,有信號分子、轉錄因子、受體、蛋白和酶等多種物質的參與,是一個復雜的過程。

從通路中可以看出,黃芪抗疲勞主要涉及癌癥通路、FOXO、Nrf2、HIF-1、MAPK、PI3K/Akt、VEGF、Ca2+、腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK/p53insulin信號通路,涉及氧化應激、DNA修復、細胞增殖、活性氧(ROS)解毒等反應。有研究表明FoxO轉錄因子作為Fox家族主要成員,是胰島素/胰島素樣生長因子(INS/IGF-1)信號通路中的關鍵因子,通過轉錄調控和信號轉導途徑在動物的生理調節、代謝和細胞周期等方面起重要作用[28]。Hribal[29]發現,在成肌細胞c2c12中,通過siRNA抑制Foxol的表達來增加肌漿球蛋白的表達有利于肌細胞分化;在依賴于Akt的肌漿蛋白生成過程中,FoxO1蛋白發揮關鍵作用,提示黃芪可以通過FoxO通路影響疲勞大鼠的肌肉分化從而緩解疲勞。Nrf2是轉錄水平細胞氧化的關鍵調節因子,它直接控制SOD、HO-1CAT的濃度。HO-1有助于將血紅素轉化為膽紅素,膽紅素是一種有效的抗氧化劑。當ROS過度積累時,Nrf2被激活并積聚在細胞質中。通過改善體內Nrf2的活性,可以有效地預防氧化應激損傷,從而緩解疲勞[20]。HIF-1是低氧條件下組織細胞產生的一種核蛋白,用于維持氧穩態的關鍵物質,它與其下游靶基因結合,使得機體低氧耐受能力增強。運動會導致機體組織細胞的運動性缺氧,骨骼肌中HIF-1α蛋白含量與基因表達會上升[30]。MAPK信號系統在機體對環境應激適應及維持機體內氧化抗氧化動態平衡狀態中發揮著重要的作用。有研究表明[31],黑果枸杞子可以有效緩解過度訓練導致的機體內環境失衡,提高機體尤其是骨骼肌的氧自由基清除能力,抑制MAPK信號通路的蛋白表達,預防和延緩運動疲勞的發生與發展。PI3K在磷酸激酶家族中的占有重要地位,它可以調節細胞的生長、凋亡,Akt是絲氨酸/蘇氨酸激酶,是PI3K下游最主要的效應分子之一。任增輝[32]研究發現大強度遞增負荷訓練會使大鼠海馬組織中PI3K、Akt蛋白及mRNA表達水平上升,能夠說明大強度遞增負荷運動能夠激活PI3K/Akt信號轉導通路,發揮其抗凋亡作用。AMPK是細胞能量代謝中的關鍵調節蛋白,AMPK激活可調節細胞凋亡[33-34]。AMPK活化導致p53的積累從而誘導肌肉組織細胞凋亡,通過抑制AMPK/p53信號通路可以抑制肌肉組織細胞的凋亡,減少組織細胞損傷,從而緩解肌肉疲勞。INS是糖與脂肪能量代謝過程中主要的調控激素。INS首先與細胞表面胰島素受體(INSR)結合,激活其β亞基的蛋白酪氨酸激酶(PTK)。胰島素受體底物蛋白(IRS)作為一種錨定蛋白可以激活至少2條已知信號途徑:一是通過IRS激活PI3K途徑;另一條是通過生長因子受體結合蛋白2Grb2/SOSRAS蛋白活化MAPK途徑[35]。

綜上所述,本研究結果顯示黃芪的11個活性成分作用于76個靶點,涉及多種過程、分子和通路,體現了黃芪多成分-多靶點-多途徑的作用特點。通過蛋白相互作用網絡預測了黃芪抗疲勞作用的21個重要靶蛋白,并對關鍵靶點作用進行歸屬,繪制通路圖,通過文獻調研對各條通路進行驗證,但還應進一步對相關靶點進行實驗驗證。

參考文獻(略) 

來  源:張  瑞,曹慶偉,李愛平,劉月濤,李  科,秦雪梅. 基于網絡藥理學的黃芪抗疲勞作用機制研究 [J]. 中草藥, 2019, 50(8):1880-1889.

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